CRISPR基因編輯實(shí)驗(yàn)中，電轉(zhuǎn)是一種常見的遞送方式。

無論是質(zhì)粒、mRNA還是Cas9蛋白與sgRNA形成的RNP復(fù)合物，都可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)體系采用電轉(zhuǎn)進(jìn)行遞送。

但實(shí)際操作中，很多實(shí)驗(yàn)人員會遇到一個問題：電轉(zhuǎn)以后細(xì)胞看起來正常，甚至能夠檢測到一定遞送信號，但最終基因編輯效率卻沒有達(dá)到預(yù)期。

這時候就不能簡單把問題歸結(jié)為“電轉(zhuǎn)效率低"。

一、遞送成功不等于編輯成功

CRISPR實(shí)驗(yàn)至少可以拆成幾個過程：

首先是材料進(jìn)入細(xì)胞；

隨后Cas9與sgRNA正常發(fā)揮作用；

再產(chǎn)生目標(biāo)位點(diǎn)切割；

最后由細(xì)胞自身修復(fù)機(jī)制完成相應(yīng)編輯。

電轉(zhuǎn)主要影響的是遞送環(huán)節(jié)，但最終編輯效率還會受到sgRNA設(shè)計、Cas9活性、目標(biāo)位點(diǎn)狀態(tài)以及檢測方式等多方面影響。

因此，看到編輯效率低時，應(yīng)先判斷問題究竟出現(xiàn)在遞送端還是編輯端。

如果連遞送材料都很難進(jìn)入細(xì)胞，重點(diǎn)應(yīng)該優(yōu)化電轉(zhuǎn)條件。

如果遞送本身沒有明顯問題，卻始終得不到理想編輯結(jié)果，則需要進(jìn)一步檢查CRISPR體系本身。

二、RNP、mRNA和質(zhì)粒的優(yōu)化思路并不相同

不同形式的CRISPR材料，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的路徑不同。

例如，RNP復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后可以較快參與編輯；mRNA需要先完成翻譯；質(zhì)粒則還涉及進(jìn)入細(xì)胞核以及后續(xù)表達(dá)。

因此，同一種細(xì)胞使用不同遞送材料時，不應(yīng)該簡單認(rèn)為原來的參數(shù)一定繼續(xù)適用。

實(shí)驗(yàn)條件變化以后，最好重新進(jìn)行小范圍驗(yàn)證。

尤其是在從質(zhì)粒體系轉(zhuǎn)換到RNP體系時，除了電脈沖參數(shù)，還應(yīng)同步關(guān)注材料用量、細(xì)胞數(shù)量以及電轉(zhuǎn)后恢復(fù)條件。

三、編輯效率和細(xì)胞存活之間仍然需要平衡

為了提高CRISPR遞送，有時會增加電刺激強(qiáng)度。

但對于原代細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞等相對敏感的細(xì)胞，如果刺激過強(qiáng)，雖然部分細(xì)胞能夠獲得較高遞送效率，但總體細(xì)胞數(shù)量可能明顯下降。

對于后續(xù)需要擴(kuò)增、篩選或者進(jìn)行功能驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)，這種結(jié)果未必理想。

因此可以同時記錄：

電轉(zhuǎn)后短期存活；

CRISPR材料遞送表現(xiàn)；

最終編輯效率；

編輯后細(xì)胞數(shù)量；

后續(xù)功能狀態(tài)。

只有最后能夠獲得足夠數(shù)量、狀態(tài)正常并完成目標(biāo)編輯的細(xì)胞，整個實(shí)驗(yàn)才真正具有實(shí)際價值。

四、每次優(yōu)化最好只解決一個主要問題

CRISPR實(shí)驗(yàn)本身變量就很多。

如果一次同時更換sgRNA、改變Cas9用量、調(diào)整電轉(zhuǎn)參數(shù)、改變培養(yǎng)體系，最后即使結(jié)果變好，也很難判斷到底是哪一步發(fā)揮了作用。

更合理的方法是把問題拆開。

例如先確定當(dāng)前遞送條件是否穩(wěn)定，再優(yōu)化CRISPR體系；或者在CRISPR體系已經(jīng)驗(yàn)證有效的情況下，集中比較不同電轉(zhuǎn)條件。

這樣得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更容易重復(fù)，也更容易形成后續(xù)能夠長期使用的標(biāo)準(zhǔn)流程。

因此，CRISPR電轉(zhuǎn)真正需要解決的并不是單獨(dú)追求“高效率"，而是把遞送、編輯和細(xì)胞狀態(tài)結(jié)合起來看。