很多研究人員剛開始接觸電穿孔實(shí)驗(yàn)時(shí)，會(huì)首先關(guān)注一個(gè)問題：電壓到底應(yīng)該設(shè)置多少？

實(shí)際上，電穿孔并不是簡單地找到一個(gè)電壓數(shù)值就能完成參數(shù)優(yōu)化。

影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素包括電壓、脈沖寬度、脈沖次數(shù)、細(xì)胞類型、遞送物類型以及緩沖體系等多個(gè)方面。因此，當(dāng)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)效率偏低或者細(xì)胞死亡較多時(shí)，更適合采用系統(tǒng)排查的方法，而不是不斷增加電壓。

一、首先判斷實(shí)驗(yàn)?zāi)壳暗膯栴}是什么

參數(shù)調(diào)整之前，首先應(yīng)該明確當(dāng)前實(shí)驗(yàn)的主要問題。

如果表現(xiàn)為細(xì)胞存活率較高，但陽性率明顯偏低，通常說明當(dāng)前處理?xiàng)l件可能不足以實(shí)現(xiàn)理想的遞送。

如果陽性率已經(jīng)比較高，但細(xì)胞大量死亡，則說明電脈沖條件可能過強(qiáng)。

另外還有一種常見情況：不同批次之間結(jié)果差異很大。這種情況下就不能只調(diào)整電壓，而應(yīng)該同時(shí)排查細(xì)胞狀態(tài)、操作流程以及設(shè)備參數(shù)的一致性。

不同問題需要采用不同的優(yōu)化方向。

二、電壓并不是越高越好

電脈沖作用的核心，是使細(xì)胞膜產(chǎn)生暫時(shí)性通透。

在一定范圍內(nèi)，提高電場(chǎng)強(qiáng)度可能有助于提高膜通透程度，但是超過細(xì)胞耐受范圍之后，膜損傷可能變得不可逆。

這也是為什么部分實(shí)驗(yàn)在提高電壓后，短時(shí)間檢測(cè)到的導(dǎo)入效率似乎增加，但培養(yǎng)一段時(shí)間之后有效細(xì)胞數(shù)量反而減少。

因此評(píng)價(jià)電穿孔條件時(shí)，不建議只看轉(zhuǎn)染率，還應(yīng)該結(jié)合細(xì)胞存活率、恢復(fù)情況以及后續(xù)功能狀態(tài)綜合判斷。

三、脈沖寬度同樣非常關(guān)鍵

除了電壓之外，脈沖持續(xù)時(shí)間也會(huì)明顯影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

較短脈沖和較長脈沖對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生的作用并不相同。

尤其針對(duì)原代細(xì)胞、免疫細(xì)胞等敏感樣本，脈沖持續(xù)時(shí)間的微小變化都有可能改變細(xì)胞耐受情況。

因此在優(yōu)化過程中，可以在相對(duì)合理的電壓范圍內(nèi)逐步調(diào)整脈沖時(shí)間，而不是一次性大范圍改變多個(gè)參數(shù)。

每次只調(diào)整少數(shù)變量，更容易判斷真正影響結(jié)果的因素。

四、不同遞送物不能簡單套用相同條件

質(zhì)粒DNA、mRNA以及CRISPR相關(guān)RNP復(fù)合物的理化性質(zhì)存在差異。

因此即使使用同一種細(xì)胞，不同遞送對(duì)象也未必適合相同的電穿孔參數(shù)。

例如質(zhì)粒DNA通常分子較大，其進(jìn)入細(xì)胞以及后續(xù)表達(dá)過程與mRNA存在明顯區(qū)別；RNP則更多關(guān)注編輯效率、細(xì)胞活率以及后續(xù)功能狀態(tài)。

如果直接把某篇文獻(xiàn)中的參數(shù)照搬到另外一種遞送體系中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)差異并不意外。

文獻(xiàn)參數(shù)更適合作為起點(diǎn)，而不是最終答案。

五、建立小范圍參數(shù)矩陣比反復(fù)試錯(cuò)更有效

對(duì)于新的細(xì)胞體系，可以先根據(jù)細(xì)胞類型和已有資料確定一個(gè)基礎(chǔ)條件，再圍繞該條件設(shè)計(jì)小范圍參數(shù)矩陣。

例如分別調(diào)整幾個(gè)相鄰電壓條件，同時(shí)保持脈沖寬度和其他條件一致；隨后再根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繼續(xù)調(diào)整脈沖時(shí)間或者其他變量。

這種方法能夠幫助研究人員逐漸縮小參數(shù)范圍。

實(shí)驗(yàn)記錄也非常重要。

建議記錄細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、遞送物濃度、緩沖體系、電轉(zhuǎn)杯規(guī)格、電壓、脈沖時(shí)間以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

當(dāng)數(shù)據(jù)積累到一定程度之后，就能夠比較清楚地判斷適合當(dāng)前樣本的參數(shù)窗口。

威尼德 V-leader 電穿孔儀可用于不同細(xì)胞和分子遞送實(shí)驗(yàn)，并可根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行脈沖參數(shù)設(shè)置。

電穿孔參數(shù)優(yōu)化的核心不是尋找所謂的“萬能參數(shù)"，而是圍繞具體樣本建立屬于自己的穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)窗口。