一、引言

二、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1. 大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞來源：選取健康的成年 Sprague - Dawley 大鼠，在無菌條件下取出眼球，采用酶消化法分離獲取視網(wǎng)膜細(xì)胞，并進(jìn)行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為含有特定比例的胎牛血清、谷氨酰胺、青霉素 - 鏈霉素等營(yíng)養(yǎng)成分的 DMEM/F12 培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為 37°C、5% CO? 的細(xì)胞培養(yǎng)箱。

2. 轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒

• 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑選用市售的產(chǎn)品（如 威尼德 ），按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行保存和使用前的準(zhǔn)備。

• 電穿孔轉(zhuǎn)染儀采用專門用于細(xì)胞電穿孔操作的儀器（如 Bio - Rad Gene Pulser、威尼德），配備相應(yīng)的電穿孔 cuvette。

• 用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒為攜帶綠色熒光蛋白（GFP）基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒在構(gòu)建過程中經(jīng)過嚴(yán)格的基因克隆技術(shù)操作，確保其序列的準(zhǔn)確性和完整性。在使用前，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行大量提取和純化處理，測(cè)定其濃度和純度，以保證轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

（二）實(shí)驗(yàn)分組與轉(zhuǎn)染操作

1. 實(shí)驗(yàn)分組

• 將培養(yǎng)至合適密度的大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞隨機(jī)分為三組：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組、電穿孔轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對(duì)照組。每組設(shè)置多個(gè)重復(fù)樣本，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2. 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作

• 在轉(zhuǎn)染前一天，將大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞接種于 24 孔板中，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到約 50% - 60% 的匯合度。

• 取適量的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑與純化后的質(zhì)粒 DNA 分別在不同的管中用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，然后將兩者輕輕混合，室溫下孵育一定時(shí)間（通常為 20 - 30 分鐘），以形成脂質(zhì)體 - DNA 復(fù)合物。

• 將形成的復(fù)合物逐滴加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板使復(fù)合物均勻分布，然后將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)（如 24 小時(shí)、48 小時(shí)、72 小時(shí)）收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

3. 電穿孔轉(zhuǎn)染操作

• 同樣在轉(zhuǎn)染前一天將大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞接種于合適的電穿孔 cuvette 中，使細(xì)胞密度達(dá)到預(yù)定要求。

• 將純化后的質(zhì)粒 DNA 加入到細(xì)胞懸液中，輕輕混勻，然后將 cuvette 放入電穿孔轉(zhuǎn)染儀中。設(shè)置合適的電穿孔參數(shù)，包括電壓（如 200 - 300 V）、脈沖時(shí)間（如 20 - 50 ms）、脈沖次數(shù)（如 1 - 3 次）等，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行優(yōu)化選擇。

• 啟動(dòng)電穿孔程序，在脈沖結(jié)束后，迅速將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至預(yù)先準(zhǔn)備好的含有完整培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后的相同時(shí)間點(diǎn)（24 小時(shí)、48 小時(shí)、72 小時(shí)）收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

（三）檢測(cè)指標(biāo)與方法

1. 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

• 熒光顯微鏡觀察：在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)，將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察。由于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒攜帶 GFP 基因，成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞會(huì)發(fā)出綠色熒光。通過隨機(jī)選取多個(gè)視野，計(jì)數(shù)發(fā)出熒光的細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比例，初步評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，觀察細(xì)胞的形態(tài)和熒光分布情況，以了解轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響。

• 流式細(xì)胞術(shù)定量分析：收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用 PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，然后重懸于適量的 PBS 中。將細(xì)胞懸液上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，通過設(shè)置合適的熒光檢測(cè)通道，對(duì) GFP 陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和分析。流式細(xì)胞術(shù)能夠提供更為精確的轉(zhuǎn)染效率數(shù)據(jù)，并且可以對(duì)細(xì)胞群體的熒光強(qiáng)度分布進(jìn)行詳細(xì)分析，從而深入了解轉(zhuǎn)染在細(xì)胞水平的異質(zhì)性。

2. 細(xì)胞毒性檢測(cè)

• MTT 法測(cè)定細(xì)胞活性：在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)，向細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入 MTT 溶液（終濃度為 0.5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng) 4 - 6 小時(shí)。然后小心吸去培養(yǎng)基，加入 DMSO 溶解結(jié)晶物，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定 570 nm 處的吸光度值。通過比較轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率，評(píng)估轉(zhuǎn)染方法對(duì)細(xì)胞活性的影響。細(xì)胞存活率 =（轉(zhuǎn)染組吸光度值 / 對(duì)照組吸光度值）× 100%。

• LDH 釋放檢測(cè)：收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照 LDH 檢測(cè)試劑盒的說明書操作，測(cè)定上清液中 LDH 的活性。LDH 是一種細(xì)胞內(nèi)酶，當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，會(huì)釋放到細(xì)胞外。通過檢測(cè)上清液中 LDH 的活性，可以間接反映細(xì)胞的損傷程度，從而評(píng)估轉(zhuǎn)染方法的細(xì)胞毒性。

3. 基因表達(dá)與蛋白水平檢測(cè)

• 實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè)基因表達(dá)：提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總 RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。然后以 cDNA 為模板，設(shè)計(jì)針對(duì)目的基因（如與視網(wǎng)膜細(xì)胞功能相關(guān)的特定基因）和內(nèi)參基因（如 GAPDH）的特異性引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR 反應(yīng)。通過比較轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組目的基因的相對(duì)表達(dá)量（采用 2 - ΔΔCT 法計(jì)算），分析轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)的影響。

• Western blotting 檢測(cè)蛋白水平：收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，采用 BCA 法測(cè)定蛋白濃度。將等量的蛋白樣品進(jìn)行 SDS - PAGE 電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上。用 5% 脫脂牛奶封閉膜后，分別加入針對(duì)目的蛋白和內(nèi)參蛋白（如 β - actin）的一抗，4°C 孵育過夜。次日，用 TBST 洗滌膜后，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育 1 - 2 小時(shí)。最后，使用 ECL 化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，通過成像系統(tǒng)采集圖像，并對(duì)目的蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析，以評(píng)估轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞蛋白表達(dá)水平的影響。

三、結(jié)果

（一）轉(zhuǎn)染效率

1. 熒光顯微鏡觀察結(jié)果

• 在轉(zhuǎn)染后 24 小時(shí)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組和電穿孔轉(zhuǎn)染組均可見部分細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，但熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例存在差異。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的熒光細(xì)胞分布相對(duì)較散在，陽(yáng)性細(xì)胞比例約為 20% - 30%；電穿孔轉(zhuǎn)染組的熒光細(xì)胞多呈聚集性分布，陽(yáng)性細(xì)胞比例相對(duì)較高，約為 30% - 40%。

• 隨著時(shí)間的推移，到 48 小時(shí)時(shí)，兩組的熒光強(qiáng)度均有所增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞比例也有所增加。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)到約 30% - 40%，電穿孔轉(zhuǎn)染組則提高到約 40% - 50%。

• 至 72 小時(shí)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的陽(yáng)性細(xì)胞比例穩(wěn)定在 40% 左右，而電穿孔轉(zhuǎn)染組的陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)一步上升至 50% - 60%。

2. 流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)果

• 與熒光顯微鏡觀察結(jié)果相符，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，在 24 小時(shí)時(shí)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率為 25.3% ± 3.2%，電穿孔轉(zhuǎn)染組為 35.6% ± 4.5%。

• 48 小時(shí)后，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率上升至 38.5% ± 4.1%，電穿孔轉(zhuǎn)染組達(dá)到 48.2% ± 5.3%。

• 72 小時(shí)時(shí)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率為 42.1% ± 3.8%，電穿孔轉(zhuǎn)染組則高達(dá) 56.8% ± 6.1%。結(jié)果表明，電穿孔轉(zhuǎn)染在大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率總體上高于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，這種差異逐漸明顯。

（二）細(xì)胞毒性

1. MTT 法測(cè)定細(xì)胞活性結(jié)果

• 在轉(zhuǎn)染后 24 小時(shí)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞存活率為 85.2% ± 5.6%，電穿孔轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞存活率為 78.3% ± 6.2%，兩組與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組（細(xì)胞存活率設(shè)定為 100%）相比，均有一定程度的細(xì)胞活性下降，但差異不顯著。

• 到 48 小時(shí)時(shí)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞存活率為 80.5% ± 4.8%，電穿孔轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞存活率下降至 70.1% ± 5.9%，此時(shí)電穿孔轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組的差異開始變得明顯（P < 0.05）。

• 72 小時(shí)后，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞存活率仍維持在 78.9% ± 5.2%，而電穿孔轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞存活率進(jìn)一步降低至 65.3% ± 6.5%，表明電穿孔轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞的細(xì)胞毒性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸顯現(xiàn)，且較脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染更為嚴(yán)重。

2. LDH 釋放檢測(cè)結(jié)果

• 轉(zhuǎn)染后 24 小時(shí)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組上清液中 LDH 活性略有升高，為對(duì)照組的 1.2 倍 ± 0.15 倍；電穿孔轉(zhuǎn)染組上清液中 LDH 活性升高更為明顯，為對(duì)照組的 1.5 倍 ± 0.2 倍。

• 48 小時(shí)時(shí)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組 LDH 活性為對(duì)照組的 1.3 倍 ± 0.2 倍，電穿孔轉(zhuǎn)染組則達(dá)到對(duì)照組的 1.8 倍 ± 0.3 倍。

• 72 小時(shí)后，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組 LDH 活性為對(duì)照組的 1.4 倍 ± 0.25 倍，電穿孔轉(zhuǎn)染組高達(dá)對(duì)照組的 2.1 倍 ± 0.4 倍。LDH 釋放檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了電穿孔轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的損傷程度大于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。

（三）基因表達(dá)與蛋白水平

1. 實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè)基因表達(dá)結(jié)果

• 針對(duì)與視網(wǎng)膜細(xì)胞功能相關(guān)的目的基因，在轉(zhuǎn)染后 48 小時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組目的基因的相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的 1.5 倍 ± 0.3 倍，電穿孔轉(zhuǎn)染組目的基因的相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的 2.0 倍 ± 0.4 倍。結(jié)果表明，兩種轉(zhuǎn)染方法均能促進(jìn)目的基因的表達(dá)，但電穿孔轉(zhuǎn)染的促進(jìn)作用更為顯著。

2. Western blotting 檢測(cè)蛋白水平結(jié)果

• 與基因表達(dá)結(jié)果一致，Western blotting 檢測(cè)顯示，電穿孔轉(zhuǎn)染組目的蛋白的表達(dá)水平明顯高于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組。通過對(duì)蛋白條帶灰度值的分析，電穿孔轉(zhuǎn)染組目的蛋白的表達(dá)量約為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的 1.6 倍 ± 0.3 倍，進(jìn)一步說明電穿孔轉(zhuǎn)染在促進(jìn)基因表達(dá)進(jìn)而影響蛋白合成方面具有更高的效率。

四、討論